摘要：葡萄酒相關(guān)酵母中主導(dǎo)酒精發(fā)酵的酵母菌為Saccharomyces（酵母屬）中的Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母），近年來(lái)隨著葡萄酒品質(zhì)的多樣化與特色化，研究者關(guān)注non-Saccharomyces（非酵母屬酵母）及非二倍體S. cerevisiae在葡萄酒風(fēng)味復(fù)雜性形成中的作用本研究對(duì)酵母菌不同倍性特征及交配型轉(zhuǎn)換等基礎(chǔ)理論研究成果進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)分析了酵母菌倍性對(duì)發(fā)酵性能、耐受性及葡萄酒風(fēng)味形成的影響，為基于倍性研究篩選葡萄酒釀造性能*的菌株提供理論研究基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，目前主要的倍性研究針對(duì)釀酒酵母開(kāi)展，但相關(guān)研究中缺乏對(duì)倍性差異影響表型如耐受性等的分子機(jī)制研究，此外，如何在發(fā)酵中有效利用非二倍體S. cerevisiae和非酵母屬酵母仍依賴于未來(lái)針對(duì)這些菌株開(kāi)展的基礎(chǔ)倍性研究。
關(guān)鍵詞：單倍體；二倍體；多倍體；釀酒酵母；非酵母屬
Research Progress in Wine-making Characteristic of Wine-related Yeast Based on Ploidy
LIANG Shu-ying, WANG Chun-xiao*
(Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy, School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang Guizhou 550025, China)
Abstract: Saccharomyces cerevisiae, an important specie from the Saccharomyces genus, is the dominant yeast species for conducting alcoholic fermentation in wine-related yeasts. With the diversification and specialization of wine in recent years, researchers have focused on the role of non-Saccharomyces and non-diploid S. cerevisiae in the complexity formation of wine flavour. This study reviews the basic theoretical research results on different ploidy characteristics and mating type conversion of Saccharomyces cerevisiae, focusing on the effects of Saccharomyces cerevisiae ploidy on fermentation performance, tolerance and wine aroma formation, and providesa theoretical basis for screening strains with excellent winemaking performance based on ploidyresearch. However, the molecular mechanism in S. cerevisiae regulating the phenotypic difference such as tolerance capacity by the ploidy difference are still unclear and need deep research. It is still a question on how to effectively use the non-diploid S. cerevisiae and non-Saccharomycesin fermentation, which still rely on the basic ploidy studies of these yeast strains in the future.
Key words: haploid; diploid; polyploid; Saccharomyces cerevisiae; non-Saccharomyces
葡萄酒是在酵母菌等微生物的作用下由葡萄或葡萄汁發(fā)酵而成的酒精飲料，研究表明，葡萄表皮、葡萄汁及發(fā)酵過(guò)程中的葡萄醪包含豐富的野生酵母資源，其中non-Saccharomyces（非酵母屬）酵母主導(dǎo)發(fā)酵初期，而Saccharomyces（酵母屬）如Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）主導(dǎo)發(fā)酵中后期[1]。酵母常以單倍體和二倍體兩種營(yíng)養(yǎng)體存在，由于二倍體比單倍體具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，因此葡萄酒釀造中分離的酵母常以二倍體形式存在[2-3]。單倍體酵母常出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)研究中，一方面可用于雜交或原生質(zhì)體融合育種，為培育發(fā)酵特性良好的酵母菌株提供菌種基礎(chǔ)，另一方面對(duì)單倍體的某些基因進(jìn)行敲除、插入或過(guò)表達(dá)可研究葡萄酒中主要風(fēng)味物質(zhì)在酵母菌細(xì)胞中的代謝途徑，為二倍體酵母菌通過(guò)發(fā)酵控制影響葡萄酒風(fēng)味提供理論支持。本研究對(duì)酵母菌不同倍性特征及交配型轉(zhuǎn)換等基礎(chǔ)理論研究成果進(jìn)行了綜述，并重點(diǎn)分析了酵母菌倍性研究對(duì)發(fā)酵性能、耐受性及葡萄酒風(fēng)味形成的關(guān)聯(lián)，為基于單倍體研究選育具有優(yōu)良葡萄酒釀造性能的二倍體菌株提供理論研究基礎(chǔ)。
目前對(duì)酵母菌倍性的認(rèn)識(shí)大都以S. cerevisiae為模式菌種進(jìn)行研究，S. cerevisiae細(xì)胞的單倍體有MATa和MATα兩種交配型，分別攜帶a和α兩種相反的接合信息[2]。MATα和MATa雜交（即攜帶相反結(jié)合信息的單倍體之間的結(jié)合，也叫作異宗配合，圖1A）可產(chǎn)生二倍體MATa/α，在自然界中分離到的S. cerevisiae二倍體大多為MATa/α基因型。此外，S. cerevisiae的二倍體還包含MATa/a和MATα/α兩種基因型[4]，這兩種基因型在天然條件下的形成概率極低[5]，在實(shí)驗(yàn)條件下可通過(guò)同宗配合制備這兩種基因型[4]。
值得注意的是，二倍體MATa/α和MATa/a、MATα/α在生長(zhǎng)上沒(méi)有顯著差異，都可以通過(guò)出芽進(jìn)行繁殖，但它們?cè)诩?xì)胞形態(tài)、產(chǎn)孢和融合能力方面有明顯不同[6]。二倍體MATa/a和MATα/α細(xì)胞起初為“三葉草”或“腳”形[7]，芽殖后產(chǎn)生子代為橢圓形，且不能通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生子囊孢子，或者偶爾會(huì)發(fā)生，其幾率小于1%[8]，而二倍體MATa/α細(xì)胞起初為啞鈴形，芽殖后產(chǎn)生橢圓形子代，且具備產(chǎn)孢能力。此外，二倍體MATa/a和MATα/α細(xì)胞可以通過(guò)和相反交配型酵母融合，從而生成更高倍型的酵母細(xì)胞[6]（圖1B）。HARARI等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，單倍體S. cerevisiae在無(wú)脅迫條件下會(huì)自發(fā)形成二倍體，但在酒精和高鹽等脅迫條件下二倍體化的頻率大大增加，且二倍體比單倍體更具有環(huán)境適應(yīng)優(yōu)勢(shì)，MATa/α菌株的生長(zhǎng)狀況*，菌株MATa/a或MATα/α次之，生長(zhǎng)*差的是單倍體菌株。在相同的環(huán)境下，二倍體比單倍體具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，更能適應(yīng)惡劣的環(huán)境并容忍突變[2]。但二倍體的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)也依賴于突變的類型，當(dāng)有害突變?yōu)殡[性突變時(shí)，二倍體菌株不表達(dá)而單倍體菌株表達(dá)該有害突變，當(dāng)有益突變?yōu)殡[性突變時(shí)，二倍體菌株不表達(dá)而單倍體菌株表達(dá)該有益突變，可以利用單倍體菌株的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)將有益突變的單倍體篩選出來(lái)，通過(guò)進(jìn)一步雜交獲得有益突變的二倍體菌株[4,10]。因此，單倍體在有害隱性突變時(shí)受影響，而在有益隱性突變時(shí)表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)[2]。KLEIMAN等[11]對(duì)芽殖酵母的基因缺失分析結(jié)果顯示，單倍體發(fā)生有害突變的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)二倍體，且大部分的有害突變是隱性的。KUTYNA等[4]發(fā)現(xiàn)親本單倍體菌株的甘油產(chǎn)量均高于他們的純合和雜合二倍體菌株的甘油產(chǎn)量，因此推斷決定S. cerevisiae甘油產(chǎn)量的突變是隱性突變。
酵母中除了單倍體和二倍體外，還存在著多倍體和非整倍體。多倍體即細(xì)胞中含有兩套以上的染色體遺傳物質(zhì)。非整倍體是指核型與正常染色體組（整倍體）不同，即比整倍體增加或丟失幾條染色體，其中，結(jié)構(gòu)非整倍體是因染色體部分重排而導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[12]。雖然自然界中的酵母都以單倍體或二倍體的形式存在，但也存在著多倍體和非整倍體。ZHU等[13]從臨床中分離的S. cerevisiae有34%鑒定為三倍體或四倍體，36%為非整倍體； EZOV等[14]從以色列卡梅爾山環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了天然存在的三倍體和四倍體S. cerevisiae。
A.二倍體S. cerevisiae的形成
B.不同二倍體和多倍體S. cerevisiae的生命周期
圖1酵母交配型的轉(zhuǎn)換及不同二倍體和多倍體的產(chǎn)生示意圖[6,12,15]
Fig.1 Schematic diagram of yeast mating type conversion and production of different diploids and polyploids
近年來(lái)，在食品領(lǐng)域關(guān)于不同酵母倍性的研究越來(lái)越多，其中葡萄酒相關(guān)酵母的倍性研究中以Saccharomyces的研究*廣泛，涉及單倍體、二倍體、多倍體和非整倍體的研究，Brettanomyces的研究次之，包含單倍體、二倍體和多倍體的基礎(chǔ)研究，其余酵母菌僅在單一倍性或某兩種倍性中有研究，如Torula單倍體的研究、Hanseniaspora二倍體的研究、Pichia多倍體的研究及Dekkera多倍體和非整倍體的研究。Saccharomyces的研究以模式菌種S. cerevisiae的倍性研究*多，相關(guān)研究包含交配型轉(zhuǎn)換及鑒定[16-17]、倍性的形成控制[18]、酵母二倍體化的機(jī)制[9]、倍性與染色體丟失之間的關(guān)系研究[19-20]、非整倍體的形成機(jī)制[21-22]、非整倍體的基因組穩(wěn)定性分析[20]、異宗配合[23]等。non-Saccharomyces的倍性研究以倍性鑒定和細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究為主，如D. bruxellensis二倍體轉(zhuǎn)化為非整倍體[21]等。與發(fā)酵特性相關(guān)的單倍體制備僅見(jiàn)于non-Saccharomyces中的Torula[24]，其他菌種未見(jiàn)報(bào)道。
倍性對(duì)S. cerevisiae發(fā)酵性能的影響研究主要包含生孢條件、單倍體制備條件[25]、單倍體的誘變與選育[9]、利用優(yōu)良單倍體進(jìn)行雜交育種[26]、多倍體的生長(zhǎng)生理特性和發(fā)酵特性研究、多倍體與非整倍體倍性的鑒定[27]等，涉及的發(fā)酵性能包含乙醇產(chǎn)量、發(fā)酵速度、殘?zhí)?、甘油等。有相關(guān)研究表明，隨著酵母倍性的增加，其生長(zhǎng)速度減慢，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞分裂次數(shù)增加，芽痕增加[12]。使用親本二倍體和單倍體分別發(fā)酵葡萄汁時(shí)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵速度相同，而且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，單倍體間會(huì)融合形成二倍體。此外，來(lái)自不同四分體的單倍體融合率低于來(lái)自同一四分體的單倍體融合率，原因是MAT位點(diǎn)與染色體III著絲粒相連而導(dǎo)致雜合性缺失[28]。同一親本的不同單倍體具有不同的CO2失重、產(chǎn)酒精、殘?zhí)恰?/span>H2S、*醇、酯類等發(fā)酵性能，推測(cè)是由于多基因控制[17,25,29]。近年來(lái)研究者較多關(guān)注酵母倍性如何影響葡萄酒發(fā)酵及如何利用酵母倍性來(lái)提高葡萄酒的風(fēng)味，但較少研究該影響背后的分子機(jī)制。
此外，非整倍體（3n-1、3n-2、4n-1、4n-2、4n-3）增加了基因組的不穩(wěn)定性，使多個(gè)染色體丟失事件時(shí)常發(fā)生[20]，非整倍體也是導(dǎo)致產(chǎn)孢量少的原因之一，但在工業(yè)酵母中，由于含有較高數(shù)量的基因拷貝數(shù)可以適應(yīng)不斷變化的發(fā)酵環(huán)境，因此可以作為非整倍體的優(yōu)勢(shì)特性[22,30]。
葡萄酒酒精發(fā)酵過(guò)程涉及不同酵母菌種此消彼長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化，該變化與發(fā)酵環(huán)境息息相關(guān)，如許多環(huán)境脅迫因子會(huì)通過(guò)影響酵母的生存代謝改變*終葡萄酒的品質(zhì)。葡萄酒酒精發(fā)酵過(guò)程中的環(huán)境脅迫因子包含SO2、乙醇、嗜殺毒素、溫度、鹽及金屬離子等，葡萄酒相關(guān)酵母對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力會(huì)影響其生存代謝，因此酵母菌的耐受性研究是葡萄酒風(fēng)味質(zhì)量研究的基礎(chǔ)內(nèi)容之一，具體見(jiàn)表1和圖3。
表1 與葡萄酒相關(guān)的酵母菌倍性在耐受性中的應(yīng)用
Tab.1 Application of wine-related yeast in tolerance analysis based on ploidy
耐受性 | 種名 | 倍性 | 倍性與耐受性的關(guān)聯(lián) | 參考文獻(xiàn) |
耐SO2能力 | S.cerevisiae | 單倍體 | 含有com2調(diào)節(jié)子的單倍體菌株耐受SO2能力高于其親本單倍體菌株 | [31] |
缺失ADE的單倍體突變體，其亞硫酸鹽的耐受性增強(qiáng) | [32] | |||
在0~100 mg/L SO2濃度范圍內(nèi)，單倍體菌株耐SO2能力低于大多數(shù)二倍體菌株 | [33] | |||
B.bruxellensis | 多倍體 | 三倍體B. bruxellensis比二倍體耐受SO2 | [27] | |
單倍體至三倍體B. bruxellensis菌株中，耐SO2能力隨著倍性增加而增加 | [34] | |||
耐乙醇能力 | S.cerevisiae | 多倍體 | 以不同倍性（單、二和四倍體）的S. cerevisiae為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)二倍體的乙醇耐受性*強(qiáng) | [35] |
S.uvarum | 與S. cerevisiae雜交形成的三倍體菌株耐乙醇能力比*二倍體親本差 | [36] | ||
S.cerevisiae | 非整倍體 | 非整倍體的乙醇耐受性會(huì)高于整倍體（移出額外的染色體Ⅲ，返回整倍體狀態(tài)，其乙醇耐受性大大降低） | [37] | |
與親本二倍體菌株相比，非整倍體的耐乙醇（8%）性降低 | [38] | |||
嗜殺毒素 | S.cerevisiae | 單倍體 | 二倍體產(chǎn)孢后，一半孢子失去嗜殺活性 | [39] |
耐溫度能力 | S.uvarum | 多倍體 | 與S. cerevisiae雜交形成三倍體菌株，其耐低溫（8℃）和高溫（39℃）能力高于親本二倍體菌株 | [36] |
S.cerevisiae | 非整倍體 | 與親本二倍體菌株相比，非整倍體的耐熱性增加 | [38] | |
耐鹽及金屬離子能力 | S.cerevisiae | 非整倍體 | 與親本二倍體菌株相比，非整倍體的耐KCl（1mol/L）、銅離子（6.25mmol/L）能力均降低 | [38] |
SO2因其抑菌和抗氧化特性在葡萄酒釀造中廣泛應(yīng)用，但其在發(fā)酵過(guò)程中的使用會(huì)影響酵母菌的活性，因此，發(fā)酵主導(dǎo)酵母菌需具備一定的SO2耐受性。相關(guān)研究顯示，酵母菌對(duì)SO2的耐受性隨倍性增加而增加[27,33-34]。以單倍體菌株為研究對(duì)象，分析可能影響SO2耐受性的基因，發(fā)現(xiàn)缺失COM2的單倍體無(wú)法在含有1.5mmol/L SO2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而缺失MSN2、MSN4和HAA1的單倍體菌株均可生長(zhǎng)，說(shuō)明COM2與酵母菌SO2耐受能力相關(guān)[31]。此外，SO2耐受能力還可能與ADE有關(guān)[32]。
乙醇是酒精發(fā)酵的主要產(chǎn)物，其含量隨發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加，在葡萄酒酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)其酒精度一般可達(dá)10~15% vol，但高濃度乙醇具有抑菌效果，因此，發(fā)酵主導(dǎo)酵母菌需具備一定的乙醇耐受性。相關(guān)研究表明（表1），非整倍體菌株耐乙醇能力大于整倍體，這一現(xiàn)象與非整倍體菌株中染色體Ⅲ有關(guān)[37]。而整倍體菌株中二倍體菌株耐乙醇能力強(qiáng)于其他倍性菌株，研究表明9個(gè)基因（ACE2、POL3、PUF4、GFA1、UTH1、JID1、RIM15、ATG11和VPS74）與乙醇耐受性有關(guān)[35]。此外，倍性會(huì)影響細(xì)胞的大小，由于SSD1和UTH1可增加細(xì)胞壁對(duì)酶的耐受性，因而細(xì)胞壁的穩(wěn)定性也會(huì)增加酵母的乙醇耐受性[40]。酵母菌的嗜殺毒素分泌能力可能與其在酒精發(fā)酵過(guò)程中的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，嗜殺能力受倍性的影響，決定嗜殺毒素分泌的基因并不存在于所有的單倍體中，一半來(lái)自四分體的單倍體會(huì)失去嗜殺活性[39]。目前對(duì)于耐嗜殺能力尚無(wú)倍性相關(guān)研究，但該研究與酒精發(fā)酵的控制關(guān)聯(lián)緊密。葡萄酒釀造過(guò)程中涉及低溫（10℃左右）或高溫（37℃或65℃）的冷/熱浸漬處理，此外，白葡萄酒的發(fā)酵溫度推薦為18~22℃，這些葡萄酒釀造條件對(duì)酵母菌的溫度耐受性提出了一定的要求。研究發(fā)現(xiàn)，隨著倍性增加，菌株的耐低溫和高溫能力增加，如三倍體菌株的耐低溫（8℃）和耐高溫（39℃）均高于其親本二倍體菌株[36]，且非整倍體及其孢子的耐熱性高于親本二倍體及其孢子[38]。
綜上所述，酵母菌的SO2、乙醇等耐受性與倍性相關(guān)，且某些基因可能直接影響酵母菌的耐受性，基于倍性研究開(kāi)展耐受能力及相關(guān)分子機(jī)制研究，可為篩選耐受性強(qiáng)的葡萄酒相關(guān)酵母提供重要的理論依據(jù)。
圖 3 葡萄酒酵母倍性與耐受性及風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)聯(lián)
Fig.3 The relation of wine yeast ploidy with tolerance and flavor substances formation
酵母菌在葡萄酒釀造過(guò)程中，將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化成乙醇、甘油、*醇、醛類和酯類等物質(zhì)，還通過(guò)自溶釋放蛋白質(zhì)和多糖等細(xì)胞成分，這些物質(zhì)是形成葡萄酒風(fēng)味的重要物質(zhì)。S. cerevisiae因具有較強(qiáng)的發(fā)酵力和耐受性，是葡萄酒釀造的主導(dǎo)菌種[10]。近年來(lái)non-Saccharomyces在葡萄酒風(fēng)味復(fù)雜性研究中受到了關(guān)注，Candida、Hanseniaspora、Kloeckera、Metschnikowia、Pichia、Schizosaccharomyces、Torulaspora、Williopsis、Zygosaccharomyces等與S. cerevisiae混合發(fā)酵可以降低乙醇和H2S含量，增加酯類、甘油、萜烯類和*醇含量[1,41-43]。研究者仍較多關(guān)注S. cerevisiae及其近親種S.uvarum的倍性對(duì)葡萄酒風(fēng)味復(fù)雜性的影響，其他酵母菌種的相關(guān)倍性研究較少，未來(lái)在S. cerevisiae倍性研究基礎(chǔ)上開(kāi)展non-Saccharomcyes的倍性研究將促進(jìn)葡萄酒風(fēng)味的多樣化與復(fù)雜性。
乙醇是葡萄酒的主要成分之一，近年來(lái)部分研究聚焦于低醇或無(wú)醇葡萄酒的釀造，研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)酵母菌的倍性變化降低乙醇產(chǎn)量（表2）：（1）通過(guò)篩選低產(chǎn)乙醇單倍體，并進(jìn)一步融合成低產(chǎn)乙醇二倍體[25,44]，可實(shí)現(xiàn)降低乙醇的目標(biāo)；值得注意的是，WYK等[16]融合獲得的二倍體菌株在乙醇產(chǎn)量方面并無(wú)顯著差異。（2）通過(guò)在單倍體菌株中插入或敲除某些基因來(lái)降低乙醇含量。研究表明單倍體菌株中插入pdc2基因會(huì)使酒精度降低13%[45]，進(jìn)一步融合為低產(chǎn)乙醇的二倍體后，與二倍體親本菌株相比，總酒精度降低了7.4%；另一研究發(fā)現(xiàn)TSA1基因缺失可降低乙醇含量[46]。（3）通過(guò)種間雜交形成多倍體從而降低乙醇含量。 LAIRóN-PERIS等通過(guò)種間雜交（S. uvarum×S. cerevisiae）獲取了低產(chǎn)乙醇的異源三倍體H14A7，該三倍體中低表達(dá)GPX2、AARE1、NDE2和ADH2基因[47]。
甘油是酒精發(fā)酵的主要副產(chǎn)物之一，可賦予葡萄酒圓潤(rùn)的口感，增加復(fù)雜性。甘油產(chǎn)量主要受代謝條件和菌株差異影響[43,47]，研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒S. cerevisiae的甘油產(chǎn)率明顯低于其他工業(yè)S. cerevisiae[48]。S. bacillaris、C. stellata、Starmerella bombicola（球擬假絲酵母）、H. uvarum、M. pulcherrima、Issatchenkia orientalis和L. thermotolerans能增加甘油產(chǎn)量[43,49],而C. sake會(huì)降低甘油含量[50]。但相關(guān)倍性研究主要集中在Saccharomyces中：由于發(fā)生性狀分離，同一株二倍體親本所獲取的單倍體后代表現(xiàn)不同的甘油產(chǎn)量[3,17,29]，通過(guò)篩選高產(chǎn)甘油的單倍體菌株，可進(jìn)一步雜交形成高產(chǎn)甘油的二倍體[3,44]。S. uvarum和S. cerevisiae雜交獲得的異源三倍體H14A7高產(chǎn)甘油[47]。倍性增加造成甘油產(chǎn)量增加可能是因?yàn)樵谌诤线^(guò)程中，引發(fā)了GPD1和GPD2的過(guò)表達(dá)，從而使甘油含量增加。
酵母菌硫代謝的中間產(chǎn)物之一為具有臭雞蛋氣味的H2S，屬于葡萄酒的不良風(fēng)味物質(zhì)之一[26]。劉美玲等[29]以4株高產(chǎn)H2S的野生二倍體S. cerevisiae（NX11315、LFE1225、LFN524和LFP525）出發(fā)制備出6株低產(chǎn)H2S、5株中產(chǎn)H2S和4株高產(chǎn)H2S的單倍體菌株，推測(cè)與H2S產(chǎn)量相關(guān)的基因?yàn)殡[性基因；而江璐[3]發(fā)現(xiàn)，低產(chǎn)H2S的二倍體S. cerevisiae菌株44y7的單倍體后代出現(xiàn)了高產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)H2S的菌株，可能是等位基因分離導(dǎo)致性狀分離，使高產(chǎn)H2S的基因性狀得以表達(dá)。在本課題組研究中，WANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)，雜合二倍體菌株GM1（LFN524高產(chǎn)H2S單倍體和LFP525低產(chǎn)H2S單倍體雜交而成）和純合二倍體菌株UCD932（所產(chǎn)生單倍體皆不產(chǎn)H2S）都不產(chǎn)H2S，但二株菌的硫代謝相關(guān)基因表達(dá)情況完全不相同，說(shuō)明了菌株遺傳背景和多基因參與對(duì)H2S代謝的影響。
酯類物質(zhì)與葡萄酒的香氣特征密切相關(guān)。江璐[3]篩選獲得兩株高產(chǎn)酯類的S. cerevisiae單倍體（174y1-3和112y4-45），其中乙酸乙酯的產(chǎn)量*，李麗等[17]從野生二倍體S. cerevisiae中篩選獲得兩株高產(chǎn)乙酯的單倍體菌株（31y3-29和174y-26），其中乙酸苯乙酯的產(chǎn)量*，賦予發(fā)酵液玫瑰花香。AGARBATI等[51]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)單倍體融合后的二倍體菌株與親本二倍體菌株相比，其乙酸異戊酯產(chǎn)量增加，而乙酸乙酯產(chǎn)量卻減少，WYK等[16]的結(jié)果與之相似，發(fā)現(xiàn)融合后的二倍體菌株增加了乙酸酯的產(chǎn)量。相關(guān)研究表明，Schizosaccharomyces、Candida pulcherrima（美極假絲酵母）、Hanseniaspora guilliermondii（季也蒙有孢漢遜酵母）、Pichia anomala（異常畢赤酵母）、P. fermentans、P. membranifaciens、T. debrueckii等都能提高葡萄酒中的酯類含量（乙酸己酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯和2-苯乙酸乙酯等）[41,52-53]，但目前尚無(wú)這些菌種的倍性研究報(bào)道。
*醇與葡萄酒的香氣特征直接相關(guān)，還可進(jìn)一步通過(guò)酯化反應(yīng)影響*醇酯的含量，通過(guò)氧化反應(yīng)影響醛類（氧化味）的形成。相關(guān)研究一方面通過(guò)制備單倍體從中篩選出低產(chǎn)或高產(chǎn)*醇的菌株：江璐[3]篩選獲得兩株高產(chǎn)*醇的單倍體菌株33y7-43和12y4-4y，其中異戊醇的產(chǎn)量*；李麗等[17]從野生二倍體S. cerevisiae中獲得一系列性狀分離的單倍體，其中9株單倍體的*醇產(chǎn)量比二倍體親本菌株低近60%，單倍體菌株的**醇產(chǎn)量為135.2mg/L。另一方面，通過(guò)單倍體融合為二倍體改變*醇的含量，AGARBATI等[51]通過(guò)單倍體融合為二倍體使異丁醇、戊醇及異戊醇產(chǎn)量降低。雖然Lodderomyces elongisporus（長(zhǎng)孢洛德酵母）高產(chǎn)異戊醇和2-苯乙醇[54]，Saccharomycodes（類酵母屬）、Schizosaccharomyces（裂殖酵母屬）、M. pulcherrima、I. orientalis、H. uvarum和H.vineae可影響*醇的產(chǎn)量[52,55]，但目前尚無(wú)這些菌種的倍性研究報(bào)道。
多糖可影響葡萄酒的“黏度”，使酒體具備豐滿的風(fēng)格。GONZALEZ等[10]發(fā)現(xiàn)缺失GAS1和GPI7的單倍體S. cerevisiae高產(chǎn)甘露糖蛋白和多糖，其釋放量分別是沒(méi)有基因缺失的對(duì)照單倍體S. cerevisiae菌株的7和9倍，進(jìn)一步以基因缺失的單倍體菌株為親本進(jìn)行雜交得到雜合和純合二倍體菌株，純合二倍體菌株與其親本單倍體菌株非常相似，高產(chǎn)甘露糖蛋白和多糖，而雜合二倍體菌株甘露糖蛋白的產(chǎn)量均低于沒(méi)有基因缺失的對(duì)照單倍體菌株。研究表明，Hanseniaspora osmophila、P. fermentans、S. ludwigii、Zygosaccharomyces bailii（拜耳接合酵母）、L. thermotolerans、M. pulcherrima和S. ludwigii可增加葡萄酒中多糖的濃度[56]，但尚缺乏相關(guān)倍性研究。
Candida、Kloeckera、Pichia、Metschnikowia、Sporidibolus、Aureobasidium、Hanseniaspora和Issatchenkia具有較高的糖苷酶活性，可通過(guò)釋放糖苷結(jié)合的風(fēng)味化合物提升葡萄酒的香味，如β-葡萄糖苷酶可提高葡萄酒中萜烯醇的濃度[57]。Debaryomyces pseudopolymorphus、Debaryomyces vanriji、P. fermentans、C. stella、C. sake、H. vineae、M. pulcherrima和S. bacillaris與葡萄酒中萜烯醇（香茅醇、香葉醇及橙花醇）的產(chǎn)量有關(guān)[52]。雖然較少S. cerevisiae菌株具備前述non-Saccharomyces菌種高產(chǎn)糖苷酶的特性，但研究發(fā)現(xiàn)，其單倍體表現(xiàn)出高于二倍體菌株的芳樟醇產(chǎn)量，而具有復(fù)雜基因背景的S. cerevisiae T73-4非整倍體菌株（近二倍體）展現(xiàn)了三倍于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室菌株（包含單倍體和二倍體）的芳樟醇產(chǎn)量，說(shuō)明具有復(fù)雜基因背景的菌株可能更適合產(chǎn)生異源單萜[58]。
綜上所述，目前大部分研究關(guān)注了倍性差異對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響，但未展開(kāi)單倍體相關(guān)基因分析，因此尚未形成相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量受倍性影響的分子機(jī)制，未來(lái)的研究可以目前研究較多的乙醇和甘油為例，拓展倍性差異影響風(fēng)味物質(zhì)的分子機(jī)制，為釀造不同風(fēng)味的葡萄酒提供理論依據(jù)。
表2葡萄酒相關(guān)酵母倍性對(duì)葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的影響
Tab.2 Effect of ploidy of wine-related yeast on flavoring substances in wine
對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響 | 種名 | 倍性研究 | 參考文獻(xiàn) |
降低乙醇 | S. cerevisiae | 敲除單倍體菌株中的TSA1基因 | [46] |
單倍體與二倍體的比較 | [33] | ||
單倍體菌株中插入PDC2基因，再進(jìn)一步融合為二倍體 | [45] | ||
單倍體融合為二倍體菌株 | [44] | ||
S. uvarum | 種間雜交（S. uvarum×S. cerevisiae）形成三倍體 | [47] | |
增加甘油 | S. cerevisiae | 單倍體篩選 | [3,17,29] |
單倍體融合為二倍體菌株 | [44] | ||
S. uvarum | 種間雜交（S. uvarum×S. cerevisiae）形成三倍體 | [47] | |
降低H2S | S. cerevisiae | 單倍體篩選 | [3,17,29] |
單倍體菌中插入MET2基因 | [59] | ||
單倍體與二倍體比較 | [33] | ||
單倍體融合為二倍體菌株 | [26,51] | ||
增加酯類 | S. cerevisiae | 篩選單倍體 | [3,17,29] |
單倍體融合為二倍體菌株 | [16,51] | ||
降低*醇 | S. cerevisiae | 篩選單倍體 | [3,17,29] |
單倍體融合為二倍體菌株 | [51] | ||
增加*醇 | S. cerevisiae | 篩選單倍體 | [3,17,29] |
增加萜烯類 | S. cerevisiae | 單倍體融合為二倍體菌株 | [58] |
增加甘露糖蛋白和多糖 | S. cerevisiae | 敲除單倍體菌株中的GAS1和GPI7基因缺失的單倍體，再融合形成二倍體 | [10] |
降低乙酸 | S. cerevisiae | 單倍體融合為二倍體菌株 | [16] |
降低乙醛 | S. cerevisiae | 敲除單倍體菌株中的TSA1基因 | [26,46] |
增加乙醛 | S. cerevisiae | 單倍體融合為二倍體菌株 | [51] |
葡萄酒相關(guān)酵母與葡萄酒的風(fēng)味特征形成息息相關(guān)，而酵母倍性研究可以促進(jìn)有益風(fēng)味和不良風(fēng)味代謝途徑的剖析，為具有穩(wěn)定有益性狀的二倍體菌株篩選和培育提供研究方法。近年來(lái)，葡萄酒相關(guān)酵母倍性研究取得了一些進(jìn)展，主要集中在Saccharomyces屬中的S.cerevisiae，相對(duì)葡萄酒相關(guān)酵母而言，研究菌種相當(dāng)局限。
第一，目前與葡萄酒風(fēng)味形成相關(guān)的酵母倍性研究多以S. cerevisiae為主，其他菌種較少，可能與其他菌種的倍性基礎(chǔ)研究較少、生孢和單倍體制備條件明顯不同于S. cerevisiae、單倍體存活率低或留存時(shí)間短等困難有關(guān)。此外，在本課題前期研究中發(fā)現(xiàn)，Hanseniaspora屬在生孢上非常困難，且不容易判斷是否產(chǎn)孢；Schizosaccharomyces雖然生孢非常容易，但由于生長(zhǎng)周期的特異性，導(dǎo)致單倍體間很容易融合為二倍體，分離出單倍體在技術(shù)上存在一定的困難。在今后的研究中，需結(jié)合S. cerevisiae的基礎(chǔ)研究成果，開(kāi)發(fā)適用于non-Saccharomyces菌種的基礎(chǔ)倍性研究技術(shù)，為其進(jìn)一步的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
第二，就S. cerevisiae的倍性研究而言，關(guān)于乙醇、H2S和甘油的相關(guān)報(bào)道較多，而酯類和萜烯類的研究較少，可能與S. cerevisiae的釀造特性有關(guān)。亟待在未來(lái)的研究中更多關(guān)注S. cerevisiae與β-葡萄糖苷酶、酯類和萜烯類等風(fēng)味形成、Hanseniaspora產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進(jìn)而釋放萜烯類物質(zhì)、S. japonicus在甘油、蘋果酸和甘露糖蛋白/多糖代謝、Pichia在酯類和多種芳香化合物（如萜烯、C13-降異戊二烯和C6化合物）代謝等方面的倍性研究，從而為葡萄酒的特色化和多樣化生產(chǎn)提供菌種基礎(chǔ)。
第三，在S. cerevisiae的倍性中，對(duì)于倍性分子機(jī)制的研究甚少。近幾年的研究集中于倍性差異會(huì)導(dǎo)致酵母的耐受性和發(fā)酵性能不同，但是沒(méi)有從分子機(jī)制的層面對(duì)這一差異作出分析解釋。
總之，目前對(duì)葡萄酒相關(guān)酵母倍性研究的報(bào)道較多，但將倍性運(yùn)用到葡萄酒發(fā)酵中的研究甚少，特別是倍性隨著發(fā)酵進(jìn)程的變化情況，以及在發(fā)酵中如何利用不同倍性酵母等，有待進(jìn)一步關(guān)注。non-Saccharomyces屬的基礎(chǔ)倍性研究將促進(jìn)其在葡萄酒發(fā)酵中的應(yīng)用，為增強(qiáng)葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性提供菌株支持。
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